Equipe : Biogenèse et traduction des ARNt
Chef d’équipe : Philippe GIEGE
Email : philippe.giege@ibmp-cnrs.unistra.fr
Directeur de thèse : Benoît CASTANDET
Email : benoit.castandet@u-paris.fr
L’objectif de la thèse est de combler une lacune dans les connaissances sur le contrôle qualité (QC) des ARN chloroplastiques. Les données de transcriptomique suggèrent que le génome chloroplastique est entièrement transcrit, ce qui, couplé à une terminaison inefficace, conduit à un transcriptome primaire très complexe. De plus, il est maintenant clair que les chloroplastes possèdent également d’abondants ARN non codants (ncRNA) qui peuvent former des duplex d’ARN avec des transcrits géniques (dsRNA) bien que l’amplitude et la signification biologique soient inconnues. Le chloroplaste s’appuie donc sur le contrôle qualité (QC) des ARN pour trier ce pool initial de transcrits afin de préserver les segments à sous-diviser, tandis que le reste est rapidement dégradé. Elle est réalisée par un ensemble de ribonucléases (RNases) décrites comme ayant une faible spécificité de séquence. Un aspect mal compris de l’expression et de la régulation des gènes chloroplastiques est la fonction des ARNs et plus globalement des processus liés aux ARN double brin. Nous avons récemment montré qu’au moins deux ribonucléases, PNPase et RNaseJ, jouent un rôle majeur dans le maintien de l’homéostasie des ARN sens/antisens. Un rôle important est d’éliminer les ARN antisens délétères qui pourraient nuire à la traduction. Le projet vise à (1) identifier l’ensemble des duplex ARN-ARN dans divers mutants de RNases et conditions de stress environnemental et (2) identifier et initier la caractérisation de nouveaux facteurs protéiques impliqués dans le métabolisme des ARNdb.
Méthodes : Dans le cadre d’un projet ANR, notre équipe a récemment développé une chaîne analytique complète permettant le suivi systématique des ARN sens, antisens et double brin dans le chloroplaste. Une combinaison de séquençage Illumina et Nanopore associée à l’outil bioinformatique DiffSegR sera utilisée pour identifier les différentes isoformes de transcrits dans les mutants de ribonucléase et dans des conditions de stress. Le métabolisme des dsRNA sera étudié grâce à l’anticorps spécifique dsRNA J2. Nous l’avons récemment utilisé pour développer un test dsRIP-Seq et l’abondance et la localisation des dsRNA in vivo seront suivies par immunolocalisation en microscopie confocale. Enfin, les protéines co-purifiantes avec les dsRNA seront identifiées par MS et les candidats prometteurs seront caractérisés en utilisant des approches classiques de génétique inverse.
Mots-clés : Chloroplaste, Arabidopsis, contrôle qualité des ARN, RNases, RNA-Seq, Nanopore, ARN double brin
Publications pertinentes :
- Delannoy E, Liehrmann A, Castandet B. L’utilisation du séquençage nanopore pour analyser le transcriptome chloroplastique par analyses bioinformatiques et par transferts d’ARN virtuels. Méthodes Mol Biol. 2024 ; 2776 : 259-267.
- Liehrmann A, Delannoy E, Launay-Avon A, Gilbault E, Loudet O, Castandet B, Rigaill G*. DiffSegR : une méthode basée sur les données RNA-Seq pour l’analyse d’expression différentielle utilisant la détection de points de changement. NAR Genom et Bioinform, 2023, 6 novembre ; 5(4) : lqad098. *co-auteurs correspondants
- MacIntosh GC et Castandet B. Les ribonucléases organellaires et sécrétoires, acteurs majeurs de l’homéostasie de l’ARN. Plant Physiology. 2020 ; 183(4) : 1438-1452.
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